NF-κB信号通路在胶质瘤放疗耐受中的作用及机制研究

【摘要】脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,具有高发病率、高度侵袭性、高死亡率的特点。该肿瘤通过对整个大脑的广泛入侵表现出了持续的恶性进展特点,并对传统的放疗具有抵抗力,故临床上治疗十分棘手。近年研究表明,术后肿瘤细胞对放疗不敏感与NF-κB信号通路活性增高有关。肿瘤的放射治疗一般是通过损伤DNA,诱导细胞凋亡,阻断细胞增殖从而消除肿瘤细胞。DNA损伤激活的NF-κB信号通路诱导细胞凋亡是放疗的主要作用机制之一。但是NF-κB通路在DNA损伤诱导的凋亡反应中是一把双刃剑,具有双重作用,其促进细胞凋亡的同时,还将诱导抗凋亡基因的表达。一旦NF-KB活性异常增高或者持续活化,则表现出抗凋亡作用,通过诱导抗凋亡及促进细胞增殖相关靶基因的表达,包括Bcl-2家族,Survivin,COX-2,CyclinD1,AKT及EGFR等,导致肿瘤细胞周期进程加快,抗凋亡能力增强,侵袭及转移能力增强,从而对放疗产生抗性。由于NF-κB介导的下游靶基因有很大一部分是细胞正常生命进程所需要的,因此广谱阻断NF-κB意味着很多不良反应的产生。理想的NF-κB抑制剂应是能特异性作用于肿瘤细胞,而非正常细胞,从而达到精确清除肿瘤细胞的目的。不同组织来源的肿瘤细胞对DNA损伤的耐受性及反应性不同,对放疗的敏感性也不同。DNA损伤诱导的NF-KB信号通路起抗凋亡作用还是促凋亡作用具有一定的组织特异性。因此深入探讨特定条件诱导NF-KB通路的分子机理、调控机制及其组织特异性,有利于我们针对NF-κB在肿瘤放疗耐受中的作用,提出特异而有效的个体化治疗方案。本研究着眼于胶质瘤对放疗不敏感这一临床问题,拟在胶质瘤细胞系T98G及U87MG中探讨NF-KB通路与基于DNA损伤诱导的胶质瘤放疗不敏感的作用机制,以期为有效的胶质瘤放疗提供理论依据。实验用细胞辐照仪处理人胶质瘤细胞系T98G及U87MG,以模拟DNA损伤环境。研究发现胶质瘤细胞系T98G及U87MG对DNA损伤诱导的细胞凋亡及增殖抑制不敏感,但抑制NF-κB活性则增强其对DNA损伤的敏感性。分子机制研究发现,DNA损伤能显著增强胶质瘤细胞中NF-κB的活性,导致NF-KB介导的靶基因,包括Bcl-κL,CyclinDl,Survivin,及IL-8等高表达,从而增强肿瘤细胞抗凋亡活性,促进肿瘤生长。利用分子生物学研究手段,发现DNA损伤可增强NEMO的SUMO化修饰。NEMO的SUMO化修饰是细胞核内的DNA损伤信号激活细胞核外的NF-κB信号通路传导的限速步骤,因此增强NEMO的SUMO化修饰对于DNA损伤诱导的NF-KB活化至关重要。进一步研究发现,NF-κB活化可促进miR-181b表达升高,而miR-181b可靶向去SUMO化酶SENP2,使其表达下降,降低了SENP2催化的NEMO去SUMO化修饰,从而促使NF-KB保持持续活化状态。而miR-181b有望成为提高胶质瘤放射治疗效果的新靶点。第一部分：DNA损伤激活人脑胶质瘤细胞NF-κB信号通路目的：探讨人胶质瘤细胞T98G,U87MG对DNA损伤诱导的细胞凋亡及增殖抑制是否敏感,及其与NF-κB信号通路的关系。方法：应用电离辐射处理T98G及U87MG细胞诱导DNA损伤。免疫荧光检测DNA损伤标志物H2AX-γ来判断DNA损伤效果。划痕实验检测细胞划痕愈合能力；流式细胞仪检测细胞凋亡；MTT检测细胞增殖；Real-timePCR检测NF-KB调控的与肿瘤生长及转移相关的靶基因的表达水平；双荧光素酶报告系统检测NF-κB的活性；Westernblot检测p-IκBα、IKBα、p50及p65水平；免疫荧光检测DNA损伤处理后T98G细胞中p65是否入核。结果：电离辐射处理T98G细胞,能造成DNA损伤；DNA损伤不影响胶质瘤细胞T98G的划痕愈合能力,不诱导其凋亡；用Bay11抑制NF-κB活性后,T98G细胞的划痕愈合能力下降,细胞增殖受抑制；抑制NF-κB活性能下调T98G细胞中DNA损伤诱导的肿瘤抗性基因,包括CyclinD1、Bcl-xL、Survivin及IL-8的表达；DNA损伤能激活胶质瘤细胞T98G及U87MG细胞中NF-κB信号通路传导,促进IκBα磷酸化及降解,从而释放NF-KB使其入核。结论：1、人胶质瘤细胞系T98G及U87MG对DNA损伤不敏感。抑制NF-κB活性后,敏感性增强。2、DNA损伤激活人胶质瘤细胞系T98G及U87MG中NF-KB信号通路。第二部分：miR-181b通过靶向SENP2正调控DNA损伤诱导的NF-κB通路活性目的：探讨DNA损伤增强人胶质瘤细胞T98G及U87MG中NF-KB通路活性的分子机制。方法：应用免疫沉淀技术检测DNA损伤后NEMO的SUMO化修饰；利用软件预测NEMO的去SUMO化酶SENP2上microRNA的作用靶点；双荧光素酶报告系统及Westernblot检测SENP23’UTR是否含有miR-181b的作用靶点；MicroRNA特异的real-timePCR检测DNA损伤处理前后U87MG细胞中microRNA表达量的变化；双荧光素酶报告系统检测miR-181b对NF-κB通路活性的调控。结果：DNA损伤能促进U87MG细胞中NEMO的SUMO化修饰；软件预测显示去SUMO化酶SENP2的3’UTR含有miR-181b作用位点；双荧光素酶报告系统及Westernblot证实miR-181b可以靶向SENP2,使其表达降低：DNA损伤后miR-181b表达升高；过表达的miR-181b会进一步增强DNA损伤诱导的NF-κB通路活性。结论：1、DNA损伤能促进胶质瘤细胞中NEMO的SUMO化修饰。2、DNA损伤后,miR-181b表达升高,miR-181b可靶向于去SUMO化酶SENP2,使其表达降低,而不能抑制NEMO的SUMO化修饰,从而进一步增强NF-κB舌性。
【作者】许瑞雪；
【导师】徐英辉；
【作者基本信息】大连医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】胶质瘤；NF-κB通路；DNA损伤；治疗抵抗；

【参考文献】
[1]张丽丹.会阴部血管瘤和血管畸形的综合治疗[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[2]周守利,李伽,任宏亮,温浩,彭银生.异质结界面电荷对突变InP/InGaAs异质结双极晶体管热场发射影响研究[J].物理学报,2013,17:525-528.
[3]张国猛.江苏省体育教育专业学生职业能力指标体系研究[D].南京体育学院,体育人文社会学,2013,硕士.
[4]刘志方,赵谡玲,徐征,杨倩倩,赵玲,刘志民,陈海涛,杨一帆,高松,徐叙瑢.利用Ag_2O/PEDOT:PSS复合缓冲层提高P3HT:PCBM聚合物太阳能电池器件性能的研究[J].物理学报,2014,06:325-329.
[5]邢鲁华.高压直流输电线路保护与故障测距原理研究[D].山东大学,电力系统及其自动化,2014,博士.
[6]张红莲.隐私权的保护与限制[D].华中师范大学,民商法学,2013,硕士.
[7]陈芳一.广州番禺明珠星钟表有限公司市场营销策略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[8]杨娇.On C-E Translation of Political Hard News from the Perspective of Manipulation Theory[D].西安外国语大学,MTI翻译,2014,硕士.
[9]陈德云.教师压力：来源分析与应对策略[D].华东师范大学,比较教育学,2004,硕士.
[10]刘豪.民国时期云南留美教育研究[D].云南师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[11]王维佳.我国台湾地区《民法·亲属》的发展及其启示[D].长春工业大学,民商法学,2013,硕士.
[12]高艳红.BTEC教学模式在中职酒店管理专业礼仪课程中的应用研究[D].河北师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[13]靳海荣.法律语言的语义分析[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[14]王庆锁,李博.鄂尔多斯沙地油蒿群落生物量初步研究[J].植物生态学报,1994,04:347-353.
[15]朱莉娅.重大群体性突发事件参与者心理和行为特征研究[D].上海交通大学,公共管理,2013,硕士.
[16]唐宏图.“双固一通”针灸法对老年阳虚机体免疫功能影响的临床实验研究[D].湖北中医学院,针灸推拿学,2004,硕士.
[17]贺欣.公路长大隧道安全检查系统设计及研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[18]张贵生.中国检验认证集团内蒙古有限公司认证业务发展战略研究[D].内蒙古大学,工商管理,2013,硕士.
[19]黄园.受教育程度对我国城镇居民消费结构的影响研究[D].湖南师范大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[20]焦红涛.苦难乡村的发现者[D].湖南师范大学,中国现当代文学,2004,硕士.
[21]张冬云.美、日现代物流经济的发展及其对中国的启示[D].吉林大学,世界经济,2004,硕士.
[22]熊晓煜.仿拟识解机制的认知研究[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[23]陈雪梅.我国主板农业类上市公司资本结构对其成长性的影响研究[D].吉林大学,农业经济管理,2014,硕士.
[24]鲁冰.MES系统在热表车间的应用鲁冰[J].电子技术与软件工程,2014,19:90.
[25]康鹏.磷酸—丙酮预处理法制取纤维乙醇的工艺优化与机理研究[D].华北电力大学,热能工程,2014,博士.
[26]张贤霖.多塔斜拉桥施工误差传播特性分析[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[27]于长江.细菌性角膜溃疡和角膜热烧伤中MMP-2、MMP-9表达的研究[D].中国医科大学,眼科学,2004,硕士.
[28]张峰.基于原料蔗糖份数据挖掘的应用研究[D].南京工业大学,2005.
[29]李远.不同玉米品种（系）对玉米蚜Rhopalosiphum maidis Fitch种群增长的影响及其抗蚜性初步鉴定[D].河南农业大学,农业昆虫与害虫防治,2012,硕士.
[30]郑旭静.龙牙楤木单体皂苷CE对大鼠离体心脏功能影响的研究[D].吉林农业大学,食品科学,2012,硕士.
[31]廖文.络合剂对阳离子在EDI中迁移的影响与多级回用的研究[D].浙江大学,废水处理,2013,硕士.
[32]赵晓丽,唐立新.带有线性恶化工件和释放时间的两个代理单机调度问题[J].自动化学报,2015,01:104-112.
[33]管培培.三维加速度计估算不同步速能量消耗应用初探[D].南京体育学院,运动人体科学,2012,硕士.
[34]孙翔.高龄产妇剖宫产住院日影响因素分析及对策研究[D].青岛大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[35]陈浩.配电网故障定位与故障恢复的研究[D].天津大学,电气工程,2013,硕士.
[36]刘文岭,韩大匡,程蒲,胡水清,王玉学,侯伯刚,王经荣,王继强.高含水油田井震联合重构地下认识体系[J].石油地球物理勘探,2011,06:930-937+1012+833.
[37]李尚颖.善治视域下的执政党意识形态建设研究[D].中共中央党校,思想政治教育,2013,硕士.
[38]郝扬.区域经济发展软环境评估研究[D].天津大学,公共管理,2013,硕士.
[39]武绍妃.探究理念下高中物理演示实验课堂教学研究[D].西南大学,课程与教学论,2013,硕士.
[40]张欣蕾.中国证券市场A、B股价格差异的实证研究[D].对外经济贸易大学,金融学,2004,硕士.
[41]周晗宇.海南岛海口湾、高隆湾、博鳌海滩沉积特征及地形演变[D].华东师范大学,港口、海岸及近海工程,2013,硕士.
[42]王立亚.黄河源区玛多县草地退化特征分析及治理模式初探[D].甘肃农业大学,2004.
[43]李博.高速公路客运及危险品运输车辆运行监控系统研究[D].长安大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[44]刘亚.基于缓解期解毒化瘀方灌肠的溃疡性结肠炎免疫机制研究[D].北京中医药大学,临床中药学,2013,硕士.
[45]代园凤.丁香假单胞菌黄瓜致病变种黄瓜株系和甜瓜株系的分子生物学比较[D].南京农业大学,植物检疫与入侵生物学,2013,硕士.
[46]郭鹏.望远镜消旋系统研究[D].中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所),机械工程,2013,硕士.
[47]吴宝燕.越南企业对外直接投资的策略研究[D].广西师范大学,企业管理,2013,硕士.
[48]李秀芝.基于功率波动的风电上网电价及调控策略研究[D].广东工业大学,电气工程,2014,硕士.
[49]董彦良.国际货币基金组织中的霸权政治[D].复旦大学,国际政治,2012,博士.
[50]曹怀龙.信息支持对工作家庭关系认知评价的影响[D].华中师范大学,应用心理,2014,硕士.